PORTFOLIO

Persistierende virale Infektionen wie z.B. Hepatitis C und HIV stellen wegen des Trägertums durch Tiere oder Menschen ein Virus-Reservoir dar, welches eine zunehmende Gesundheitsbedrohung bedeutet. Besonders im Bereich der Impfung, aber ebenso hinsichtlich Therapie der Infektion selbst und ihrer Langzeitkomplikationen, sind die Erfolge bescheiden oder unzureichend. Geläufige Konzepte und Mittel der Immunisierung, wie sie für nicht persistierende virale Infektionen erfolgreichst eingesetzt werden, scheitern in den oben genannten Fällen. Daher sind neue Konzepte dringend von Nöten. Zwingende Voraussetzung dafür ist aber ein besseres Verständnis der Vorgänge, die zur Erkrankung führen. Am renommierten Forschungsinstitut “The Scripps Research Insitut in La Jolla/USA wird gegenwärtig ein entsprechendes Forschungsprogarmm durchgeführt, das die Faktoren analysiert, welche ein Virus zytolytisch bzw. nicht-zytolytisch und damit persistierend machen. Ziel dieses Projektes ist es, basierend auf molekularvirologischen Methoden, die Technologie zu erarbeiten, um LCMV gänzlich aus Plasmid-cDNA und somit nach exaktem, willentlich festgelegtem „Bauplan“ herzustellen, um Viren zu erhalten, welche sich zum Beispiel nur in einer einzigen Determinante vom „normalen“ Virus unterscheiden oder Determinanten fremder Viren anstelle der eigenen aufweisen. Mit diesen rekombinanten Viren soll in einem nächsten Schritt der Infektionsverlauf und die Immunantwort in der Maus studiert werden, um insbesondere die Frage zu erläutern, warum LCMV die Fähigkeit hat, sich einer effektiven Abwehr durch Antikörper zu entziehen, welche ein Persistieren vergleichbarer Viren wie dem Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) verhindert.

Das Kleinprojekt ermöglicht im Sinne einer Spontanförderung die Beteiligung eines Schweizer Nachwuchswissenschafters an einem innovativen Forschungsprogramm in den USA und den entsprechenden Wissenstransfer zur Heimuniversität nach dessen Rückkehr. Es sind alle Voraussetzungen vorhanden (hervorragende Labors, neueste Techniken, grosse Erfahrung mit den gebrauchten Viren), die Studie auf molekularer DNA-Ebene erfolgreich anlaufen zu lassen und danach im Zürcher Labor bei R. Zinkernagel weiterzuführen.

Die Methodik zur Herstelllung rekombinanter negativ-Strang RNA Viren ist gerade erst ein gutes Jahrzehnt alt. Dies liegt darin begründet, dass anders als für positiv-Strang Viren das Einbringen des Virusgenoms in eine Zelle mittels Transfektion nicht zur Infektion der betreffenden Zelle führt. Vielmehr muss das Virusgenom in einem Komplex mit verschiedenen viruseigenen Proteinen als sogenanntes Ribonukleoprotein (RNP) in eine Zelle eingebracht oder als ebensolcher Komplex in der Zelle selbst hergestellt werden, was besondere experimentelle Schwierigkeiten mit sich bringt. Entsprechende Techniken wurden zwar für verschiedene Virusfamilien bereits erfolgreich erarbeitet und angewendet, doch ist es bislang noch keiner Forschergruppe geglückt, in ähnlicher Weise ein Virus aus der Familie der Arenaviren, wozu auch LCMV gehört, genetisch zu verändern.
Um diesen Erschwernissen von Anfang an Rechnung zu tragen und die Erfolgschancen des Projekts zu erhöhen, wurden parallel zwei technisch grundlegend verschiedene Zugänge zur Problemstellung beschritten. Neben dem ursprünglich angestrebten Prinzip, ein rekombinantes LCMV mit dem Glycoprotein von VSV (rLCMV/VSVG) gänzlich aus Plasmiden und daher mit allen seinen Genom-Bestandteilen neu herzustellen (“Rescue von Plasmid”), wurde auch nach dem biologischen Prinzip des Austausch einzelner Gensegmente zwischen verschiedenen Virusstämmen der gleichen Familie (Reassortment) vorgegangen. Bei dieser Methode wird entsprechend Palese’s Pionierarbeiten mit Influenza Virus nur ein Genomsegment des Virus durch ein rekombinantes ersetzt.
Langwierige Vorarbeiten waren zunächst notwendig um alle molekularen Bausteine (Plasmide) zu generieren, die für einen solches Experiment notwendig sind. Zudem wurde eine Methode zur intrazellulären Herstellung des viralen Genoms verwendet (zelluläre Polymerase I), die für Viren der Arenavirusfamilie und verwandte Viren, die im Zytoplama von Wirtszellen replizieren, noch nie verwendet worden war. An Hand dieser Methode gelang es aber schliesslich, das oben beschriebene rekombinante Virus rLCMV/VSVG im Reassortanverfahren herzustellen. Ebenso schwierig war es jedoch, das rekombinante Virus in einem zweiten Schritt aus einer anfänglich grossen Überzahl nicht rekombinanter LCM Viren zu isolieren. Letzterer Prozess war nur mittels einer gänzlich neuartigen Selektionsmethode möglich, welche neben der vorliegenden Anwendung zusätzliche neue Einsicht in Bereiche der Biologie von LCMV geliefert hat. Es hat sich nämlich herausgestellt, dass LCMV zur Herstellung seines Glycoproteins eine Protease (S1P) der Wirtszelle verwendet, welche dem Cholesterinstoffwechsel dient. Die Abhängigkeit einer jeden Zelle von diesem lebenswichtigen zellulären Faktor ermöglicht dem Virus erst, sich weitgehend in jedem Gewebe zu vermehren. In künstlich veränderten Zellen, welche kein S1P besitzen und nur mittels künstlicher Zugabe von Cholesterin am Leben erhalten werden, war das normale LCMV in seiner Propagation schwer beeinträchtigt. Das rekombinante Virus hingegen mit dem Glycoprotein von VSV war auf S1P nicht angewiesen und konnte sich auch in S1P defizienten Zellen normal vermehren. Dies erlaubte uns schliesslich, das erste rekombinante Virus aus der Familie der Arenaviren zu isolieren.
In einem ersten Schritt wurden die molekularen Charakteristika von rLCMV/VSVG in vitro analysiert und es wurde unter anderem festgestellt, dass sich eine Zellkultur persistent mit dem rekombinanten Virus infizieren lässt wie auch mit dem normalen LCMV möglich ist, nämlich ohne, dass die infizierten Zellen sichtbaren Schaden nehmen. Dies war erstaunlich, weil das Glycoprotein von VSV als zelltoxisch bekannt ist. Offensichtlich gelingt es aber dem Virus, dieses Protein in hinreichend tiefen Mengen herzustellen, welche mit einer friedlichen Koexistenz von Virus und Wirtszelle vereinbar sind. Erste Versuche in neugeborenen Mäusen zeigten zu unserem beträchtlichen Erstaunen, dass Ähnliches sogar in vivo möglich ist.
Fortführung des Projektes: Entsprechend der ursprünglichen Absicht, wurden alle Reagenzien zur Herstellung rekombinanter LCM Viren sowie das rekombinante Virus selbst per Mitte März 2002 ans Institut für Experimentelle Immunologie des Universitätsspital Zürich transferiert. Dort werden zur Zeit die in den USA entwickelten Techniken etabliert, um in Zukunft für gezielte Fragestellungen der Immunologie weitere rekombinante LCM Viren herstellen zu können. Gleichzeitig werden im Mausmodell anhand von rLCMV/VSVG Fragen der Immunologie und des Virus-Wirt Gleichgewichtes analysiert. Damit ergibt sich aus dem vorliegenden Projekt ein neuer interdisziplinärer Zugang zur Immunologie und Virologie.

Lee K. J., Perez M., Pinschewer D. D., and de la Torre J. C., Identification of the Lymphocytic Choriomeningitis Virus (LCMV) Proteins Required to Rescue RNA Analogs into LCMV-Like Particles, J. Virol. 2002;76(12), 6393-7.
Pinschewer D. D. , Perez M., de la Torre J. C., Role of the virus nucleoprotein in the regulation of lymphocytic choriomeningitis virus transcription and RNA replication. J. Virol., in press
Pinschewer D. D., Perez M., Sanchez A. B. , de la Torre J. C. Isolation of a recombinant lymphocytic choriomeningitis virus expressing the glycoprotein of vesicular stomatitis virus. Manuscript in preparation

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